Preview

Альманах клинической медицины

Расширенный поиск

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЫЯВЛЕНИЯ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ ГЕНА PIK3CA С ПОМОЩЬЮ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧНОЙ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ И ЕГО ВАЛИДАЦИЯ В ОПУХОЛЯХ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

https://doi.org/10.18786/2072-0505-2015-41-12-18

Полный текст:

Аннотация

Цель – разработать высокочувствительную систему для выявления соматических мутаций в кодонах 542 и 545 экзона 9 и в кодоне 1047 экзона 20 гена PIK3CA, составляющих более 80% всех соматических мутаций этого гена, с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени для работы с гистологическим материалом без проведения макро и микродиссекции и произвести анализ ассоциаций этих мутаций с клиническими и морфологическими характеристиками опухолей молочной железы.
Материал и методы. Применен метод аллель-специфичной ПЦР с детекцией сигнала с помощью TaqMan зондов. Для определения его аналитической чувствительности стандартными генно-инженерными методами с использованием мутагенеза были сконструированы плазмиды, несущие исследуемые мутации, приготовлены образцы ДНК, несущие разный процент мутации относительно дикого типа (5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,25%).
Результаты. Проведена разработка и оптимизация мультиплексной аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени для выявления наиболее распространенных соматических мутаций в гене PIK3CA: p.E542K c.1624G>A, p.E545K c.1633G>A, p.H1047R c.3140A>G,p.H1047L c.3140A>T. Аналитическая чувствительность выявления мутаций составила 0,5% для p.E542K и 0,25% для p.E545K, p.H1047R и H1047L. Разработанный метод был использован для выявления указанных соматических мутаций в ДНК, выделенной из парафиновых блоков опухолей больных раком молочной железы. Показано, что частота встречаемости соматических мутаций гена PIK3CA увеличивается по мере прогрессии опухоли – 9,6% в опухолях I–II стадии против 21% в опухолях III–IV стадии (83 и 324 образца соответственно, p = 0,022) в основном за счет увеличения встречаемости мутации p.H1047R c.3140A>G, локализованной в каталитическом домене фермента.
Заключение. Разработанный метод детекции соматических мутаций в гене PIK3CA является достаточно чувствительным, специфичным и производительным, что позволяет рекомендовать данную методику для потокового скрининга в клинико-диагностической лаборатории с целью прогнозирования течения заболевания, мониторинга ответа опухоли на терапию и ее коррекции.

Об авторах

М. Л. Филипенко
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет
Россия
Филипенко Максим Леонидович – кандидат биологических наук, заведующий лабораторией фармакогеномики, научный сотрудник


Д. В. Шамовская
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск
Россия
Шамовская Дарья Вадимовна – сотрудник


Н. А. Оськина
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск
Россия
Оськина Наталья Александровна – сотрудник


И. П. Оскорбин
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет
Россия
Оскорбин Игорь Петрович – сотрудник, аспирант


Е. А. Храпов
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет
Россия
Храпов Евгений Александрович – сотрудник


Л. К. Овчинникова
Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина, Москва
Россия
Овчинникова Лариса Константиновна –  кандидат медицинских наук, хирург-онколог, отделение опухолей молочных желез


Е. С. Герштейн
Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина, Москва
Россия
Герштейн Елена Сергеевна – доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической биохимии


Н. Е. Кушлинский
Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина, Москва
Россия
Кушлинский Николай Евгеньевич –  доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией клинической биохимии


Список литературы

1. Samuels Y, Wang Z, Bardelli A, Silliman N, Ptak J, Szabo S, Yan H, Gazdar A, Powell SM, Riggins GJ, Willson JK, Markowitz S, Kinzler KW, Vogelstein B, Velculescu VE. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science. 2004;304(5670):554.

2. Karakas B, Bachman KE, Park BH. Mutation of the PIK3CA oncogene in human cancers. Br J Cancer. 2006;94(4):455–9.

3. COSMIC database http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic

4. Zhao L, Vogt PK. Class I PI3K in oncogenic cellular transformation. Oncogene. 2008;27(41):5486– 96. doi: 10.1038/onc.2008.244.

5. Gustin JP, Karakas B, Weiss MB, Abukhdeir AM, Lauring J, Garay JP, Cosgrove D, Tamaki A, Konishi H, Konishi Y, Mohseni M, Wang G, Rosen DM, Denmeade SR, Higgins MJ, Vitolo MI, Bachman KE, Park BH. Knockin of mutant PIK3CA activates multiple oncogenic pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(8):2835–40. doi: 10.1073/ pnas.0813351106.

6. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith JC, Markham AF. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 1989;17(7):2503–16.

7. Board RE, Thelwell NJ, Ravetto PF, Little S, Ranson M, Dive C, Hughes A, Whitcombe D. Multiplexed assays for detection of mutations in PIK3CA. Clin Chem. 2008;54(4):757–60. doi: 10.1373/clinchem.2007.098376.

8. Li B, Kadura I, Fu DJ, Watson DE. Genotyping with TaqMAMA. Genomics. 2004;83(2):311–20.

9. Pang H, Flinn R, Patsialou A, Wyckoff J, Roussos ET, Wu H, Pozzuto M, Goswami S, Condeelis JS, Bresnick AR, Segall JE, Backer JM. Differential enhancement of breast cancer cell motility and metastasis by helical and kinase domain mutations of class IA phosphoinositide 3-kinase. Cancer Res. 2009;69(23):8868–76. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-09-1968.

10. Miled N, Yan Y, Hon WC, Perisic O, Zvelebil M, Inbar Y, Schneidman-Duhovny D, Wolfson HJ, Backer JM, Williams RL. Mechanism of two classes of cancer mutations in the phosphoinositide 3-kinase catalytic subunit. Science. 2007;317(5835):239–42.

11. Chakrabarty A, Rexer BN, Wang SE, Cook RS, Engelman JA, Arteaga CL. H1047R phosphatidylinositol 3-kinase mutant enhances HER2-mediated transformation by heregulin production and activation of HER3. Oncogene. 2010;29(37):5193–203. doi: 10.1038/onc.2010.257.


Для цитирования:


Филипенко М.Л., Шамовская Д.В., Оськина Н.А., Оскорбин И.П., Храпов Е.А., Овчинникова Л.К., Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЫЯВЛЕНИЯ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ ГЕНА PIK3CA С ПОМОЩЬЮ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧНОЙ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ И ЕГО ВАЛИДАЦИЯ В ОПУХОЛЯХ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. Альманах клинической медицины. 2015;(41):12-18. https://doi.org/10.18786/2072-0505-2015-41-12-18

For citation:


Filipenko M.L., Shamovskaya D.V., Oskina N.A., Oscorbin I.P., Khrapov E.A., Ovchinnikova L.K., Gershteyn E.S., Kushlinskii N.E. DEVELOPMENT OF A MULTIPLEX ALLELE-SPECIFIC REAL-TIME PCR METHOD FOR DETECTION OF PIK3CA GENE SOMATIC MUTATIONS AND ITS VALIDATION IN THE TUMORS OF BREAST CANCER PATIENTS. Almanac of Clinical Medicine. 2015;(41):12-18. (In Russ.) https://doi.org/10.18786/2072-0505-2015-41-12-18

Просмотров: 390


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2072-0505 (Print)
ISSN 2587-9294 (Online)