Применение метода интерференционной микроскопии для изучения структурных характеристик дермальных фибробластов в культуре

Актуальность. Применение методов электронной, атомно-силовой и конфокальной микроскопии для скрининга биологически активных соединений, изделий медицинского назначения и экспресс-диагностики ряда заболеваний на клеточном уровне связано с трудоемкой и длительной пробоподготовкой, которая не исключает возможность погрешностей измерений и возникновения артефактов. Этих недостатков лишен метод модуляционной интерференционной микроскопии, позволяющий осуществлять неинвазивные исследования клеточной структуры, получать изображение с нанометровым разрешением и проводить анализ оптических свойств объекта.

Цель – оценить возможность использования метода интерференционной микроскопии при изучении морфофункциональных характеристик ядер клеток в культуре на примере дермальных фибробластов при воздействии митомицином in vitro.

Материал и методы. Нативную культуру дермальных фибробластов человека 6-го пассажа, выращенную на стекле с зеркальным напылением в лаборатории культуры клеток Института экспериментальной медицины и биотехнологий ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, исследовали при помощи модуляционного интерференционного микроскопа МИМ-340 (АО «ПО «УОМЗ», Россия). Оценивали динамику структурных характеристик ядер дермальных фибробластов при воздействии митомицином в условиях in vitro. Контрольную группу составила культура фибробластов, культивированная в аналогичных условиях на стеклах с зеркальным покрытием без добавления митомицина. Исследования на МИМ-340 проводили через 3 часа, 1 сутки и 4 суток после воздействия цитостатиком. Контрольную группу исследовали в те же сроки.

Результаты. Показано, что культура клеток, выращенная на диэлектрических стеклах, по морфофункциональным характеристикам не отличается от культуры, выращенной на культуральном пластике. Тем самым доказана возможность изучения адгезивной культуры в нативном состоянии с использованием интерференционной микроскопии. Установлено, что на однократное воздействие митомицином 0,04% клетки отвечают изменением формы на шаровидную и резким увеличением фазовой толщины ядер (217,8 против 142,18 нм в контрольной группе, p ≤ 0,05). В последующие сроки происходит восстановление морфофункциональных характеристик клеток, что подтверждается динамикой изменений плотности культуры, формы и размеров клеток, а также фазовой толщины ядра.

Заключение. Полученные результаты позволяют рекомендовать метод модуляционной интерференционной микроскопии для изучения токсичности и биосовместимости лекарственных средств, а также изделий медицинского назначения и физических факторов, используемых для диагностики и лечения.

1. Нефедова ИФ, Россинская ВВ, Волова ЛТ, Болтовская ВВ, Кулагина ЛН. Использование возможностей интерференционной микроскопии для изучения культуры адгезивных клеток. Современные проблемы науки и образования. 2017;(5) [электронный ресурс]. Доступно на: https://scienceeducation.ru/ru/article/view?id=26800 (дата обращения: 29.09.2017).

2. Popescu G, Park Y. Quantitative phase imaging in biomedicine. J Biomed Opt. 2015;20(11): 111201. doi: 10.1117/1.JBO.20.11.111201.

3. Лопарев АВ, Игнатьев ПС, Индукаев КВ, Осипов ПА, Мазалов ИН, Козырев АВ. Высокоскоростной модуляционный интерференционный микроскоп для медико-биологических исследований. Измерительная техника. 2009;(11):60–4.

4. Бункин НФ, Суязов HB, Шкирин AB, Игнатьев ПС, Индукаев КВ. Определение микроструктуры газовых пузырьков в глубоко очищенной воде по измерениям элементов матрицы рассеяния лазерного излучения. Квантовая электроника. 2009;39(4):367–81. doi: 10.1070/QE2009v039n04ABEH013892.

5. Yang SA, Yoon J, Kim K, Park Y. Measurements of morphological and biophysical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson's disease. Cytometry A. 2017;91(5):510–8. doi: 10.1002/cyto.a.23110.

6. Василенко ИА, Кардашова ЗЗ, Тычинский ВП, Вишенская ТВ, Лифенко РА, Валов АЛ, Иванюта ИВ, Агаджанян БЯ. Клеточная диагностика: возможности витальной компьютерной микроскопии. Вестник последипломного медицинского образования. 2009;(3–4):64–8.

7. Иванова ЕВ, Щербакова ЭГ, Рабинович ОФ, Барсуков АА, Ежова ЕГ, Василенко ИА. Современные подходы к патогенетической терапии плоского лишая слизистой оболочки рта. Стоматология. 2005;84(5):28–31.

8. Evans AA, Bhaduri B, Popescu G, Levine AJ. Geometric localization of thermal fluctuations in red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(11):2865–70. doi: 10.1073/pnas.1613204114.

9. Арсенюк АЮ, Павлова ИБ, Игнатьев ПС. Исследование процесса L-трансформации в популяции сальмонелл методами электронной лазерной интерференционной микроскопии. Сельскохозяйственная биология. 2013;48(6):55–60. doi: 10.15389/agrobiology.2013.6.55rus.

10. Тычинский ВП, Николаев ЮА, Лисовский ВВ, Кретушев АВ, Вышенская ТВ, Мулюкин АЛ, Сузина НА, Дуда ВИ, Эль-Регистан ГИ. Исследования ранних стадий прорастания спор Bacillus licheniformis методом динамической фазовой микроскопии. Микробиология. 2007;76(2):191–9.

11. Власова ЕА, Василенко ИА, Суслов ВП, Пашкин ИН. Динамика морфометрических показателей тромбоцитов периферической крови как критерий оценки тромбогенности диализных мембран. Урология. 2011;(2): 36–41.

12. Кулагина ЛН, Болтовская ВВ, Долгушкин ДА, Нефедова ИФ, Россинская ВВ, авторы; ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, патентообладатель. Способ обработки предметных стекол с зеркальным покрытием. Пат. 2639768 Рос. Федерация. Опубл. 22.12.2017.

13. Tychinsky V, Kretushev AV, Klemyashov IV, Zverzhkhovskiy VD, Vyshenskaya TV, Shtil AA. Quantitative phase imaging of living cells: application of the phase volume and area functions to the analysis of "nucleolar stress". J Biomed Opt. 2013;18(11):111413. doi: 10.1117/1.JBO.18.11.111413.